絕大多數有限細胞系及連續細胞系在體外進行原代培養時都是貼壁生長的，培養的細胞一經接觸培養基質就迅速鋪展并開始有絲分裂，逐漸形成致密的細胞單層，這種培養方式稱為單層細胞培養。
單層培養的細胞系在進行原代培養時，隨著培養時間的延長和細胞的不斷分裂，一則細胞之間相互接觸而發生接觸抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面由于營養物質消耗殆盡、代謝廢棄物不斷積累，導致細胞停止生長甚至死亡。此時，為獲得大量的、穩定的同種細胞，并保證細胞始終維持快速生長，可以將單層細胞從培養基質上分離下來制成單細胞懸液，按照推薦濃度接種到若干個新的培養器皿內繼續培養，這個過程就稱為傳代（Passage）或再培養（Subculture）。
單層細胞傳代培養，需要將細胞間及細胞與培養基質之間的連接打斷。對于某一些松散貼壁的細胞類型，只需輕敲培養器皿側面，細胞就會脫離下來。絕大多數貼壁細胞需要使用蛋白水解酶例如，trypsin/EDTA消化破壞上述連接。還有少數細胞需要使用機械力，例如使用細胞刮，使細胞分離下來。對單層培養而言，細胞生長接近指數生長期末時（大約70%-90%匯合），即可進行傳代。一般生長穩定的細胞4~7天傳代一次。
單層培養傳代步驟：
1. 事先將培養基、Trypsin-EDTA溶液、Trypsin中和液、DPBS在室溫平衡，并準備若干已包被好poly-L-lysine或Fibronectin等的培養器皿。
注：不推薦使用37℃水浴鍋對上述溶液進行平衡。
2. 將長滿細胞的培養器皿中原有培養液吸棄，DPBS洗滌細胞1-2次。
3. 加入適量（略蓋過細胞即可）Trypsin-EDTA溶液室溫孵育0.5-2 min，不定時在顯微鏡下觀察細胞狀態，直至約80%細胞收縮、變圓突起（round up），立即加入等體積Trypsin中和液終止消化。
注：不同類型細胞消化時間長短不一，佳消化時間需自行摸索。
4. 輕輕晃動培養容器使細胞脫離，并將消化下來的細胞收集、轉移到離心管內。另取適量*培養基潤洗培養容器，將殘留的細胞一并轉移至離心管。
注：細胞收集完畢后，可以在顯微鏡下觀察培養容器內還有多少細胞殘留（通常應少于5%），以此判斷細胞收獲是否*。
5. 將收獲的細胞懸液于1000rpm下離心5min，棄上清，然后用適量*培養基重懸細胞。
6. 計數細胞，然后根據推薦的接種密度重新接種到新的已包被好的培養皿內。將培養器皿置于37℃, 5% CO2/95% air培養箱培養，視細胞生長情況，每隔2-3天換一次液，詳見datasheet。
注：有限細胞系的增殖速率較低，其原代培養通常以1:1，1:2或1:3的比例進行傳代，但是對于增殖速率很高的連續細胞系（或無限細胞系），通常要以更高的比例進行傳代。
